Казмирчук Вера Евстафиевна, доктор медицинских наук, профессор, директор

Мальцев Дмитрий Валериевич, кандидат медицинских наук,
заместитель директора Институт иммунологии и аллергологии Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца

1. Вирусологический метод, сущность которого состоит в выделении вируса в культурах чувствительных клеток (например, фибробластов) или куриных эмбрионах, по-прежнему остаётся “золотым стандартом” диагностики вирусных инфекций человека, поскольку характеризуется высокой чувствительностью (85-100 %) и специфичностью (100 %), позволяет получить чистую культуру вируса для дальнейшего изучения, в частности испытания чувствительности к противовирусным препаратам. Однако существенная дороговизна и трудоёмкость препятствуют его широкому внедрению в повседневную клиническую практику. Результаты вирусологического метода получают слишком поздно (от 2-х до 14-ти дней), чтобы использовать такую диагностику при неотложных состояниях (например, при вирусном энцефалите или сепсисе).

2. Электронная микроскопия позволяет выявить вирусные частицы в исследуемом образце и определить видовую принадлежность вирионов по их морфологическим признакам, однако этот метод малодоступен для клинической практики и используется в основном в научных целях.

3. Биологическая проба состоит в заражении чувствительных лабораторных животных (белых мышей или кроликов) биоматериалом, полученным от больного герпетической инфекцией; метод может быть использован в спорных случаях герпесвирусной инфекции, например, для диагностики атипического герпетического энцефалита.

4. Методы определения вирусной ДНК:

а) гибридизация ДНК– высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. Метод определяет способность исследуемой вирусной ДНК гибридизироваться (специфически связываться) с меченной комплементарной ДНК известной природы, на основании чего делается вывод о видовой принадлежности исследуемого образца. Специфичность указанного метода прямо пропорциональна длине комплементарной полинуклеотидной цепочки. В качестве маркера применяют ферменты (например, пероксидазу, щелочную фосфатазу) или изотопы. Кроме того, для выявления феномена гибридизации проводят электрофорез в геле, позволяющий дифференцировать электрофоретическую подвижность комплементарной ДНК и комплекса “комплементарная ДНК – ДНК вируса”.

б) полимеразная цепная реакция (ПЦР) – наиболее широко используемый сегодня метод диагностики герпетических инфекций человека, который предложил Мюллис в 1983 году. В основе метода лежит катализуемое ферментом ДНК-полимеразой многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК, представляющего диагностический интерес. При этом для амплификации, т.е. синтеза ДНК-матрицы, отбирают наиболее консервативную часть вирусного генома, обычно какой-нибудь уникальный ген, который наиболее чётко отличает его от прочих патогенов. Этапы метода:

1) термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки (30-40 с при 93-95о С);

2) охлаждение среды;

3) внесение видоспецифических праймеров, т.е. фрагментов ДНК, комплементарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек ДНК исследуемого возбудителя; для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера, которые являются комплементарными нитям ДНК на обоих концах специфического фрагмента;

4) внесение термостабильной ДНК-полимеразы, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК;

5) повторный подогрев;

6) охлаждение среды;

7) повторное внесение праймеров;

8) повторение процедур подогрева и охлаждения;

9) после 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию путём электрофореза или иммунофлуоресцентным методом [31].

Взаимодействие праймеров с ДНК-полимеразой и ДНК-матрицей называется отжигом, поскольку реакция происходит за 20-30 с при 50-65о С. В результате достраивания цепей ДНК в специфическом фрагменте под действием ДНК-полимеразы формируется специфический фрагмент – ампликон. Таким образом, ампликон состоит из цепи ДНК-матрицы, праймера и достроенного к нему с помощью ДНК-полимеразы фрагмента полинуклеотидной цепи. Как указывалось выше, после окончания первого цикла проводят повторные, а синтезированные в них ампликоны служат матрицами для последующих этапов. При этом рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить около 108 ампликонов (рис. 1).

Рис. 1. Принципиальная схема постановки ПЦР

Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода. При проведении качественной ПЦР можно определить лишь факт присутствия вируса, однако невозможно оценить его репродуктивную активность, что неприемлемо при диагностике герпетических инфекций, при которых необходимо проводить дифференциальный диагноз между латентными, персистирующими и реактивированными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР даёт определённую информацию о содержании копий вирусных ДНК, которая выражается в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++), однако наиболее целесообразно проводить именно количественный вариант метода, при котором можно получить точные числовые значения.

Надо понимать, что полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе ввиду феномена амплификации, который имеет место при проведении ПЦР. Однако всё же имеется определённая пропорциональность между исходным количеством генетического материла и конечным результатом исследования, которая соблюдается лишь в случае проведения диагностики в стандартных условиях с использованием одних и тех же реактивов. Поэтому такие данные можно применять в клинической диагностике, если проводить обследование пациента в динамике в одной и той же лаборатории. Если же необходимо установить абсолютное количество вирусной ДНК в пробе, то проводят нормализацию полученных результатов (сравнение с количеством продуктов некоторых стабильных генов, экспрессия которых одинакова при различных условиях).

ПЦР учитывает основные недостатки метода гибридизации ДНК, в частности характеризуется повышенной чувствительностью, что связано с искусственным повышением содержания вирусной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале. Также за счёт проведения этой реакции существенно ускоряется время получения результата.

ПЦР – высокоточный метод; теоретически для получения результата достаточно иметь в среде всего одну молекулу ДНК возбудителя. Чувствительность ПЦР составляет 98 %, а специфичность – 94 %. Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологических процедур проведения исследования, а также при использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные можно получить при подсчёте результатов методом электрофореза, что связано с контаминацией воздушной среды рабочего пространства ампликонами, полученными в ходе предварительных постановок. Поэтому использование так называемых открытых методик подсчёта результатов требует проведения интенсивной вентиляции помещений. Гораздо лучше использовать закрытые методики подсчёта, например, иммунофлуоресцентные детекторы, при которых нет прямого контакта между продуктами реакции и воздушной средой, а результаты исследования являются более корректными.

Наиболее точной является методика так называемой real-time ПЦР, т.е. ПЦР в реальном времени. Её отличительным свойством является подсчёт количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого амплификационного цикла, а не в конце постановки. При этом используются две методики регистрации результатов: при помощи флуоресцентных “красок”, которые напрямую взаимодействуют cдвуцепочечной ДНК и обеспечивают её свечение, и модифицированных ДНК-олигонуклеотидных проб (рис. 2, 3). Последние содержат специфические последовательности ДНК, комплементарные уникальным генам исследуемого патогена, а также флуорофор и “гаситель” (quencher), присоединённые к молекуле-носителю, называемой reporter (“переносчик”). Флюорофор отсоединяется от “гасителя” и обеспечивает феномен свечения только после гибридизации специфических олигонуклеотидных последовательностей с комплементарной исследуемой ДНК.

Рис. 2. Принцип real-time ПЦР с использованием модифицированных ДНК-олигонуклеотидных проб

(рис. с сайта http://en.wikipedia.org)

Даже количественная ПЦР не всегда позволяет адекватно разграничить латетные и реактивированные инфекции, так как в обоих случаях имеет место наличие вирусной ДНК. Для подобной дифференциальной диагностики используют ПЦР обратной транскрипции (reverse transcription PCR), при помощи которой можно подсчитать количество вирусной мРНК, которое указывает на интенсивность экспрессии вирусных генов. Высокое количество мРНК патогена свидетельствует о реактивированной инфекции.

Рис. 3. Стадии real-time ПЦР с использованием модифицированных ДНК-олигонуклеотидных проб

(рис. с сайта http://en.wikipedia.org)

1 – интактная проба (гаситель и флюорофор связаны друг с другом); 2 – проба гибридизируется с комплементарной нитью исследуемой ДНК; 3 – под влиянием ДНК-полимеразы проба разрушается и флюоресцент высвобождается (эффект свечения)

 

Продолжение – в части 2

 

 

Раздел книги В.Е. Казмирчук, Д.В. Мальцев

"Клиника, диагностика, лечение герпесвирусных инфекций человека"