Для определения резистентных свойств вируса применяются методы генотипирования и фенотипирования.

Результаты этих исследований определяют выбор дальнейшей тактики лечения. При проведении генотипирования вируса с помощью стандартных диагностических систем получают информацию о резистентности вируса к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ), ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ) и ингибиторам протеазы (ИП). Кроме того, некоторые коммерческие лаборатории определяют резистентность вируса к ингибитору интегразы и ингибитору слияния; эти исследования нужно заказывать отдельно. На сегодняшний день в США нет одобренных для применения в клинической практике тест-систем для оценки резистентности вируса к CCR5-блокаторам методом генотипирования.

Методы генотипирования

Методы генотипирования выявляют мутации резистентности в соответствующих генах вируса. Большинство методов генотипировании основаны на секвенировании генов протеазы и обратной транскриптазы для выявления известных мутаций, обеспечивающих резистентность к лекарственным препаратам. Кроме того, сейчас некоторые коммерческие лаборатории определяют мутации резистентности в генах, кодирующих интегразу и гликопротеин наружной оболочки gp41. Генотипирование занимает немного времени: результаты, как правило, можно получить уже через 1–2 недели от момента забора крови. Для интерпретации результатов генотипирования нужны сведения о мутациях, которые появляются под действием тех или иных антиретровирусных препаратов, а также о перекрестной резистентности к другим антиретровирусным препаратам, которую приобретают мутантные штаммы. Американское отделение Международного общества борьбы со СПИДом (IAS–USA) составило и постоянно обновляет перечень мутаций в генах, кодирующих обратную транскриптазу, протеазу, интегразу и наружные белки оболочки, которые обеспечивают клинически значимую резистентность вируса к препаратам. База данных Стэнфордского университета по резистентности ВИЧ к лекарственным препаратам также служит хорошим подспорьем при интерпретации результатов генотипирования. Сейчас разработано множество алгоритмов, помогающих интерпретировать результаты генотипирования. В клинических исследованиях было показано, что если результаты генотипирования интерпретирует специалист по резистентности ВИЧ к лекарственным препаратам, вирусологические результаты лечения значимо улучшаются. Поэтому практическим врачам настоятельно рекомендуется консультироваться со специалистами-вирусологами по поводу интерпретации результатов генотипирования и подбора оптимальной схемы АРТ для дальнейшего лечения пациента.

Методы фенотипирования

При исследовании фенотипа вируса оценивается его способность к репликации при разных концентрациях антиретровирусных препаратов. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих обратную транскриптазу и протеазу, а впоследствии также гена, кодирующего интегразу, и гена, кодирующего белки наружной оболочки, извлекаются из РНК ВИЧ, выделенной из плазмы крови пациента, и либо встраиваются в геном лабораторного штамма ВИЧ, либо используются для создания рекомбинантного вируса, экспрессирующего гены ВИЧ, выделенные из крови пациента. Репликация этих вирусов при разных концентрациях антиретровирусных препаратов оценивается по экспрессии гена-репортера и сравнивается с репликацией контрольного штамма ВИЧ дикого типа. Вычисляется концентрация препарата, подавляющая репликацию вируса на 50% (т. е., медианная подавляющая концентрация, IC 50), а затем определяется отношение IC 50 изучаемого вируса к IC 50 контрольного вируса (кратность увеличения IC 50 или коэффициент резистентности).

В коммерческих лабораториях сейчас применяются методы автоматического фенотипирования с предоставлением результатов через 2–3 недели. Однако стоимость фенотипирования существенно выше, чем стоимость генотипирования. Кроме того, интерпретировать результаты фенотипирования бывает достаточно сложно, поскольку недостаточно информации о вероятности неудачи терапии при определенных коэффициентах резистентности (т. е. кратности увеличения IC 50), хотя для некоторых антиретровирусных препаратов уже установлены клинически значимые пороговые величины коэффициентов резистентности, при превышении которых препараты можно считать неэффективными.

К недостаткам как генотипирования, так и фенотипирования относятся отсутствие единых требований к качеству для всех применяющихся методик и диагностических наборов, относительно высокая стоимость исследований и нечувствительность к малочисленным штаммам вируса. Резистентные штаммы, составляющие менее 10–20% от общей циркулирующей популяции вируса, скорее всего, не будут обнаружены современными методами. Этот недостаток имеет важное практическое значение, поскольку после отмены препарата, способствующего отбору резистентных штаммов, вирус дикого типа часто снова становится доминирующим штаммом в плазме крови пациента. В результате доля штаммов вируса с мутациями резистентности уменьшается до величины ниже порогового значения 10–20%. Вирусы с мутациями резистентности к некоторым препаратам вытесняются вирусом дикого типа в течение 4–6 недель после отмены этих препаратов. Результаты проспективных клинических исследований показали, что повторное назначение неэффективных антиретровирусных препаратов (или назначение препаратов с похожими профилями резистентности) пациентам, у которых, казалось бы, резистентные штаммы исчезли из крови, обычно быстро приводит к неудаче терапии, при этом вирус, обнаруживаемый в крови, обладает прежними мутациями резистентности, т. е. является «потомком» сформировавшегося ранее резистентного штамма вируса, сохранившегося в латентных резервуарах. Поэтому результаты определения резистентности вируса наиболее информативны, если получены на фоне приема неэффективных препаратов или в течение 4 недель после их отмены (AII). Поскольку резистентные штаммы могут сохраняться в плазме крови некоторых пациентов в течение длительного времени, сохраняется некоторая вероятность выявления мутаций резистентности через 4–6 недель после отмены антиретровирусных препаратов. Однако к отсутствию выявленных мутаций резистентности в такой ситуации следует относиться с настороженностью, а к составлению следующей схемы антиретровирусной терапии подходить очень вдумчиво.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:

Применение методов определения резистентности вируса в клинической практике

Определение резистентности вируса к лекарственным препаратам

РНК ВИЧ: Определение вирусной нагрузки