Додаток 1

ЗАТВЕРДЖЕНО

наказом МОЗ України

23.09.2004 № 467

Вступ

Лабораторна діагностика інфекційних хвороб складається з класичних методів виділення збудників на відповідних поживних середовищах або у біосистемах з їх ідентифікацією та визначення приросту специфічних антитіл у парі сироваток хворих у серологічних реакціях (реакції нейтралізації, реакції гальмування гемаглютинації, реакції зв'язування комплементу, реакції імунодифузії, преципітації і інших). Як правило, ці методи пролонговані у часі, специфічна діагностика продовжується від 3-5 днів до 2-3-х тижнів. Між тим інфектологія потребує визначеності відносно етіології хвороби у більш стислий термін.

З другої половини 20-го сторіччя почалася розробка методів експрес-діагностики інфекційних хвороб, за допомогою яких збудник або його антигени виявляють безпосередньо у клінічному матеріалі протягом декількох годин (робочого дня) і які з успіхом використовуються у лабораторній практиці й досі. Серед останніх - метод флюоресціюючих антитіл (МФА), реакція непрямої гемаглютинації (РНГА), реакція латексаглютинації (РЛА), імуноферментний аналіз (ІФА), радіоімунний аналіз (РІА) та інші. Дуже поширеними в останні роки стали методи виявлення окремих ділянок геномів збудників інфекційних хвороб, зокрема полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) у різних своїх модифікаціях. Використання саме цих методів значно прискорило етіологічну діагностику інфекційних хвороб. Але для виконання МФА, ІФА, РІА, ПЛР потрібні умови добре облаштованої потужної лабораторії та коштовне обладнання і апаратура, персонал, що має високу кваліфікацію, тощо.

Стратегія наближення медичних установ до пацієнта, тобто наявність лікувально-профілактичних закладів амбулаторного типу у територіально найвіддаленіших районах, де відсутні облаштовані лабораторії; необхідність надання медичної допомоги, зокрема переливання крові, в ургентних умовах при виникненні критичних станів (травми, екологічні лиха, інші надзвичайні ситуації), - потребували розробки і застосування більш простих у виконанні, але чутливих та специфічних методів лабораторної діагностики інфекційних хвороб. Насамперед саме для цих умов і були створені швидкі тести. Як свідчить світовий досвід швидкі тести доцільно використовувати в інфектології для етіологічної лабораторної діагностики інфекційних хвороб, які є пріоритетними для охорони здоров'я України. Це ВІЛ-інфекція/СНІД, туберкульоз, вірусні гепатити В, С, сифіліс, грип та інші. Більшість з цих інфекційних захворювань становить також ризик професійного зараження медичних працівників, які надають медичну допомогу інфікованим та хворим, і складають проблему нозокоміальних заражень у медико-профілактичних закладах.

Швидкі тести для специфічної етіологічної лабораторної діагностики інфекційних хвороб (вірусних гепатитів В і С, ВІЛ-інфекції, хламідіозу, сифілісу та інших) - це прості у використанні діагностичні набори, які дозволяють отримати результат дослідження протягом декількох хвилин. Вони є альтернативою використанню класичних діагностичних тест-систем, бо не потребують застосування дорогого устаткування і висококваліфікованого персоналу. Вони засновані на тих же принципах імунологічних реакцій, застосуванні таких же імунобіологічних продуктів, що і добре відомі класичні ІФА тест-системи. Їм притаманна висока чутливість та специфічність. В різних країнах світу, в тому числі і високо розвинутих, такі тести давно й успішно застосовуються не тільки в інфектології, але й у багатьох інших галузях медицини. Вони необхідні як для поодиноких досліджень, так і в великому їх потоці, коли треба швидко, вірогідно і, що важливо, недорого одержати результат. Сьогодні такі швидкі тести випускають багато фірм-виробників. Впровадження швидкої діагностики на основі імунохроматографічного аналізу підтримують ВООЗ і Глобальний фонд, вони рекомендуються для застосування в міжнародних програмах по контролю за хворобами, що передаються статевим шляхом, в програмах, пов'язаних з ВІЛ-інфекцією/СНІДом та інших.

У Росії діагностика інфекційних хвороб із застосуванням зазначених швидких тестів проводиться вже протягом майже 10 років. За цей період основними споживачами виявили себе, насамперед, організації самостійних форм діяльності, консультативні кабінети, сімейні лікарі, лікарі швидкої та невідкладної медичної допомоги. Все більшу зацікавленість до швидких тестів проявляють керівники державних медичних установ і закладів, що мають не досить забезпечені лабораторії, проте бажають одержувати достовірні результати дослідження без використання дорогого устаткування.

У запропонованих нових методичних рекомендаціях автори узагальнили найсучасніші матеріали, що широко представлені в науковій літературі, набутий власний досвід застосування швидких тестів, що зареєстровані в Україні, в діагностиці інфекційних хвороб, особливо таких актуальних, як вірусні гепатити, ВІЛ-інфекція/СНІД, герпесвірусні інфекції, грип, тощо. Не залишилися поза увагою авторів питання правильного вибору тестів, їх місця або "ніші" в лабораторній діагностиці інфекційних хвороб та інтерпретації отриманих даних.

Представлені вперше методичні рекомендації є результатом плідної спільної праці колективів двох кафедр провідних вузів України - кафедри вірусології КМАПО ім. П.Л. Шупика та кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України.

Методичні рекомендації призначені для лікарів-вірусологів, трансфузіологів, мікробіологів, епідеміологів, інфекціоністів, педіатрів, неонатологів, сімейних лікарів, хірургів широкого профілю, акушер-гінекологів, стоматологів, наркологів, гастроентерологів, спеціалістів центрів СНІДу, фтизіатрів.

1. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ, ОБМЕЖЕННЯ ТА ВИМОГИ ДО ЗАСТОСУВАННЯ ШВИДКИХ ТЕСТІВ

За типом імунологічної реакції, яка лежить в основі створення тесту, та умов проведення дослідження, сучасні швидкі тести можна розділити на декілька груп.

До першої групи належать швидкі тести, які є ДОТ-варіантом твердофазного ІФА ("Dot blot" - тести), і при використанні яких тверду фазу з реагентом занурюють у досліджуваний зразок. Такі тест-системи отримують все більше поширення в тих випадках, коли необхідно швидко отримати результат поодиноких аналізів в лабораторній діагностиці інфекційних хвороб. Наприклад, за їх допомогою можна визначити маркери гепатиту В: HBsAg, анти-HBs, анти-HBc Ig M та Ig G; антитіла до ВІЛ 1/2 та інші.

В таких тестах, твердою фазою можуть служити, наприклад полістиролові гребінки з 12 зубцями кожна, в яких на одне дослідження виділяється по 1 зубцю. На зубці гребінок нанесені по 2 реагуючі зони (для внутрішнього контролю та досліджуваної проби). Наприклад, в тест-системі, яка розроблена для визначення HBsAg в сироватці крові, на нижній ділянці кожного зубця гребінки адсорбовані анти-HBs антитіла, до яких при занурюванні зубців у досліджувану сироватку приєднується HBsAg (якщо він є в ній) з утворенням специфічного імунного комплексу. Утворений специфічний імунний комплекс виявляється, як і в класичному ІФА, внаслідок взаємодії з кон'югатом.

Важливо усвідомити, що занурювання зубців проводиться у спеціальну робочу ванну, що має 6 рядів по 12 лунок у кожному. В лунках робочої ванни міститься певний розчин реагенту, готовий до застосування на різних етапах постановки реакції. Тест проводиться поетапно, переміщенням гребінки або її окремого зубця, із ряду в ряд із відповідною інкубацією на кожному етапі. До початку роботи з тестом зразки сироватки крові або плазми додаються до розчинника, що міститься в першому рядку ванни. У позитивному випадку хромогенний субстрат в подальшому розкладається ферментом, утворюючи кольорову пляму на гребінці. Дослідження супроводжується внутрішнім, позитивним та негативним контролями. Облік результатів проводиться візуально. Тривалість дослідження - 3-4 години.

Другу групу швидких методів діагностики складають імунохроматографічні тести, при використанні яких досліджуваний зразок наносять на поверхню твердої фази-мембрани з попередньо нанесеним на ній реагентом, а результат аналізу має вигляд забарвленої смуги.

В основі імунохроматографічного аналізу (ІХА) лежить специфічна взаємодія антигенів і антитіл на хроматографічній мембрані після змочування її рідиною досліджуваного зразка або буферним розчином. Така взаємодія відбувається внаслідок дифузного переміщення забарвленого колоїдним золотом (КЗ) індикаторного імунного компоненту ІХА, який заздалегідь нанесений на мембрану, та антигенів або антитіл досліджуваного зразка після нанесення останнього на мембрану. Для візуального виявлення специфічної імунної реакції в певній зоні-смузі хроматографічної мембрани попередньо жорстко сорбовані необхідні відомі компоненти додаткових імунологічних реакцій, які дозволяють сконцентрувати барвник у вигляді забарвленої смуги. Введений у тест-систему "з залишком" індикаторний забарвлений імунний компонент дифундує по хроматографічній мембрані далі від місця проявлення специфічної імунної реакції і зупиняється знов у контрольній смузі внаслідок імунологічної взаємодії з жорстко іммобілізованим там імунним компонентом іншої специфічності. Забарвлення контрольної смуги свідчить про те, що дослідження було проведене коректно.

У різних швидких ІХА-тестах використовують три типи антитіл:

1. Мобільні моноклональні антитіла до досліджуваного антигену або антитіл, які кон'юговані з колоїдним золотом, тобто барвником. Такі антитіла нанесені на хроматографічний папір поблизу зони внесення фізіологічної рідини досліджуваного зразка.

2. Поліклональні антитіла до досліджуваного антигену або антитіл, які жорстко адсорбовані у тестовій (досліджуваній) зоні тест-касети.

3. Вторинні антитіла до моноклональних антитіл, які жорстко іммобілізовані у контрольній зоні тест-касети.

В Україні зареєстрована низка швидких тестів для лабораторної діагностики інфекційних хвороб на основі ІХА.

Тест-касета в цих тестах являє собою нітроцелюлозну мембрану, заправлену у пластикову касету, на якій позначені: місце внесення зразка для дослідження, місце появи результатів специфічного тесту (Т), місце розташування контрольної смуги (К), назва маркеру, для виявлення якого розроблений даний швидкий тест. Тест-касета запаяна у пластиковий пакет разом з силікагелем та гепаринізованою піпеткою для внесення зразка. Тобто, надані для дослідження матеріали - це: тест-касета, одноразова піпетка, буфер (тільки для дослідження цільної крові) та інструкція.

Необхідні, але не надані матеріали: пробірки (тільки для венозної крові або сироватки чи плазми), ланцети (для взяття цільної крові з пальця), центрифуга (тільки для плазми), годинник або таймер.

При здійсненні швидкої діагностики інфекційних хвороб необхідно дотримуватись певних застережень:

а) не використовувати тест-касети після закінчення терміну придатності;

б) не можна палити, їсти, пити, застосовувати косметику або маніпулювати з контактними лінзами у зонах, де відбувається підготовка зразків до дослідження та здійснюється тест-діагностика;

в) поводитися зі зразками, як з потенційно інфікованим матеріалом, дотримуючись правил протиепідемічного режиму при дослідженні та при деконтамінації і знищенні відпрацьованого матеріалу, зокрема, працювати тільки у захисних рукавичках, а розлиті зразки або реактиви знезаражувати, відповідними дезінфікуючими засобами;

г) тест-касети необхідно зберігати при кімнатній температурі або у - холодильнику (від 2 до 30 град. С), так як волога та температура можуть впливати на результати тесту. Тест-касети зберігають у запаяному пакеті (з силікагелем для утримання необхідної вологості) до початку проведення дослідження.

УВАГА! Тест-касети не можна заморожувати! Найкраще їх зберігати при кімнатній температурі (+18-22 град. С), не допускаючи температурні коливання в широких межах!

Збір зразка та його підготовка до дослідження: для експресного виявлення специфічних антигенів або антитіл досліджують або суцільну кров (з вени або з пальця), або сироватку чи плазму крові.

Для відбору суцільної крові з пальця потрібно:

- помити руки пацієнта водою з милом або протерти змоченою у спирті ваткою;

- рухами від зап'ястя до кінчиків пальців розім'яти середній або безіменний пальці, не торкаючись місця проколу;

- проколоти шкіру стерильним ланцетом, витерти першу краплю крові;

- м'яко масажуючи палець, досягти утворення достатньої краплі крові;

- використовуючи піпетку, набрати нею приблизно 50 (мю)l) крові, при цьому необхідно уникати утворення бульок, та внести весь об'єм крові у зону S (лунку) тест-касети;

- можна вносити досліджувану суцільну кров з пальця шляхом стікаючої краплі: підвести палець пацієнта зверху зони S на касеті та капнути дві краплі крові у центр лунки або торкнутися стікаючою краплею безпосередньо центру лунки (S);

- суцільну кров з пальця необхідно дослідити негайно, не зберігаючи.

Для отримання сироватки необхідно зібрати кров у ємність без коагулянту, дати крові згорнутися, відділити сироватку якомога швидше, щоб уникнути гемолізу, і перенести її у окрему пробірку або флакон.

Для отримання плазми кров збирають у ємність з коагулянтом, потім, після осідання формених елементів (центрифугуванням), відділяють плазму в окрему ємність.

Сироватку і плазму вносять у зону S на касеті. Зразки сироватки і плазми крові можуть зберігатися протягом 3-7 днів при температурі +2-(+8) град. С, для довготривалого зберігання - при температурі нижче -20 град. С. Перед тестуванням заморожені зразки розморожують та ретельно перемішують.

УВАГА! Зразки не можна заморожувати та розморожувати декілька разів.

Суцільна венозна кров може зберігатися при температурі +2-(+8) град. С та використовуватися для тестування протягом двох днів.

УВАГА! Заморожувати цільну кров не можна.

У випадку необхідності транспортування зразки упаковують згідно з відповідними санітарно-епідемічними вимогами.

Перед використанням касету, буфер та зразки необхідно витримати при кімнатній температурі стільки часу, щоб їх температура дорівнювала кімнатній (15-30 град. С).

Порядок дослідження:

Відкрити запаяний пакет, витягнути тест-касету та розмістити на робочому столі горизонтально. Підготувати необхідне устаткування та протокол дослідження.

Для зразків суцільної крові з пальця - наповнити піпетку кров'ю та видавити приблизно 50 (мю)l) її у лунку S на касеті, після чого додати 1 краплю буферу (приблизно 40 (мю)l) та зазначити час;

використовуючи краплю крові, що падає з пальця - внести 2 краплі суцільної крові у центр лунки S на касеті, потім додати 1 краплю буферу та зазначити час.

Для зразків сироватки або плазми: тримаючи піпетку вертикально, внести 3 краплі сироватки або плазми (приблизно 75 (мю)l) у лунку S на касеті та зазначити, час.

Для зразків суцільної венозної крові: тримаючи піпетку вертикально, внести 2 краплі суцільної венозної крові (приблизно 50 (мю)l) у лунку S на касеті, додати 1 краплю буфера (приблизно 40 (мю)l) та зазначити час.

У всіх варіантах дослідження дочекатися появи червоної лінії або ліній. Результат обліковувати через 15 хвилин. Не брати до уваги результати після 20 хвилин.

Тлумачення результатів дослідження швидкими тестами вказане у відповідних розділах методичних рекомендацій при детальній характеристиці конкретних специфічних тестів. Тест може оцінюватись, як позитивний, негативний або сумнівний. Як позитивний - при наявності двох чітких забарвлених смуг у зонах Т та К (найчастіше), або як негативний - при наявності однієї забарвленої смуги (червона контрольна смуга) у зоні К. Поява червоної контрольної смуги підтверджує також і те, що був використаний достатній об'єм досліджуваного матеріалу (зразку) та дотримані всі необхідні умови тесту. Тест може оцінюватись як сумнівний тоді, коли контрольна смуга не проявляється (Схема 1).

Зовнішні контрольні реагенти до тест-касет не додаються, але рекомендовано використовувати позитивні (що мають специфічний імунний компонент, який досліджують) та негативні (що не мають специфічного антигену або антитіл, які досліджують) специфічні контролі, якщо тестування здійснюється в лабораторії і якщо вони є в лабораторії.

Схема 1. Тлумачення результатів дослідження.

Швидкі тести, які використовують для лабораторної діагностики інфекційних хвороб, мають такі обмеження:

1. Вони застосовуються виключно, як методи якісної діагностики (є/немає), і не можуть визначати концентрацію або іншу кількісну характеристику антигенів або титр антитіл.

2. Як і у всіх випадках діагностики інфекційних хвороб, результати швидких тестів повинні братися до уваги у сукупності з повнотою наявності клінічної інформації.

3. Швидкі тести не виявляють антигенів або антитіл, якщо вони присутні в зразку в кількості, яка знаходиться за межею чутливості методу (наприклад, для визначення HBsAg він має бути в зразку в кількості, не меншій за 1 нг/мл). Тому у випадках, коли результат швидкого тесту негативний, а симптоми певної інфекції наявні, рекомендується додаткове тестування з використанням інших лабораторних методів (ІФА, ПЛР).

4. Відносна чутливість більшості швидких тестів дорівнює 99%, відносна специфічність їх близько 98 %.

УВАГА! Негативні результати, отримані швидкими тестами, не вимагають подальшої верифікації.

Вимоги до використання швидких тестів:

- Лікувально-профілактичні заклади (ЛПЗ) та станції переливання крові (СПК) отримують швидкі тести для лабораторної діагностики інфекційних хвороб згідно з рознарядкою головного лікаря ЛПЗ або СПК.

- Для проведення досліджень використовуються лише зареєстровані в Україні швидкі тести.

- До початку застосування швидких тестів в лабораторії або іншому відділенні ЛПЗ або СПК фахівці, які будуть проводити та оцінювати результати дослідження, - повинні пройти відповідну підготовку.

- Не рекомендується проводити дослідження більше 3-4 зразків одним працівником одночасно.

- Тлумачення результатів доцільно здійснювати двома фахівцями. В екстрених випадках дозволяється оцінювати результат аналізу одним працівником.

- Досліджуваний зразок на ВІЛ-інфекцію, який був обстежений за допомогою швидкого тесту, незалежно від втриманого результату тестування передається протягом 3-х діб у лабораторію діагностики ВІЛ-інфекції/СНІДу для верифікації дослідження методами ІФА, ІБ, ПЛР або іншими методами.

- Приміщення для проведення досліджень швидкими тестами рекомендовано обладнати холодильником, ємностями для інактивації використаних тестів та зразків, що досліджувалися, за необхідності - центрифугою і термостатом.

- Результат дослідження на ВІЛ-інфекцію реєструють у формі № 498/о "Журнал протоколів проведення лабораторної діагностики інфекційних хвороб за допомогою швидких тестів", яка має знаходитись у лабораторії або відділенні ЛПЗ, СПК за місцем проведення дослідження (див. - додаток).

- При отриманні негативного результату, у відділення надається форма № 209/о "Результат аналізу", яка зберігається у "Медичній карті стаціонарного хворого" - форма № 003/о або в "Історії пологів" - форма № 096/о, або в "Медичній карті донора", або в іншій медичній документації.

- При отриманні позитивного або сумнівного результату дослідження зразків швидкими тестами подальші дії мають відповідати певним наказам МОЗ України. Наприклад, при отриманні позитивного результату швидкими тестами на ВІЛ-інфекцію подальші дії регламентовані наказом МОЗ України № 120 від 25.05.2000 "Про вдосконалення організації медичної допомоги хворим на ВІЛ-інфекцію/СНІД" та діючих інструкцій у закладах служби крові.

Третю групу швидких тестів складають аглютинаційні тести, в основу яких покладене специфічне склеювання сенсибілізованих антигенами або антитілами еритроцитів (реакція непрямої аглютинації - РНГА) і часток латексу (реакція латекс аглютинації - РЛА).

РНГА традиційно застосовують в лабораторній діагностиці багатьох вірусних інфекцій, в тому числі, гепатиту В. Цей метод менш чутливий, ніж ІФА, але в найкращих еритроцитарних діагностикумах чутливість реакції досягає 10 нг білку на 1 мл сироватки. Наведемо приклад застосування РНГА для виявлення HBsAg ВГВ.

Принцип методу: на формалінізованих еритроцитах фіксовані анти-HBs- (це і є еритроцитарний діагностикум), які при наявності HBsAg формують з ним імунологічний комплекс, що спричинює гемаглютинацію, тобто зсідання еритроцитів на дно лунки планшету в формі перевернутої парасольки. В випадку негативного результату еритроцити з діагностикуму осідають на дно лунки "ґудзиком". Постановку РНГА супроводжують відповідними контролями. Важливим етапом проведення РНГА є підтвердження отриманих позитивних результатів в нейтралізаційному тесті специфічності (ефект гемаглютинації гальмують додаванням специфічних анти-HBs імуноглобулінів).

Тривалість аналізу - біля 1 години.

LIKAR.INFO по матерiалах МОЗ України