Додаток 1
ЗАТВЕРДЖЕНО
наказом МОЗ України
23.09.2004 № 467

2.1. ВІРУСНИЙ ГЕПАТИТ В

Гепатит В є однією з найактуальніших проблем інфектології. Це пов'язано не тільки з досить важким перебігом цієї хвороби у певної частини хворих, але із хронізацією її у 6-10% дорослих та у 70-90% дітей першого року життя, а також з подальшою еволюцією хвороби у цироз печінки та гепатоцелюлярну карциному. В Україні зареєстровано близько 1 млн. хворих на хронічний гепатит В, які є джерелом цієї інфекції для оточуючих. Особливості епідемічного розповсюдження гепатиту В, збудник якого передається парентеральним шляхом, включають існування груп людей з підвищеним ризиком зараження цією інфекцією. Серед них і медичні працівники, особливо хірургічних та стоматологічних спеціальностей. В умовах виникнення аварійної ситуації під час надання невідкладної медичної допомоги хворому застосування швидких тестів етіологічної діагностики гепатиту В є безумовно доцільним і виправданим, оскільки допоможе медичному працівнику вжити заходів екстреної профілактики гепатиту В. В практиці дільничного терапевта, педіатра та сімейного лікаря невеликих районних лікарень, сільських амбулаторій швидкі тести допоможуть зорієнтуватись у етіологічному діагнозі гепатиту, скласти уяву про стан здоров'я пацієнта при оформленні медичної картки або картки здоров'я особи тощо.

Хроматографічна мембрана для визначення HBsAg ВГВ має- у своїй стромі декілька компонентів: у зоні внесення досліджуваного зразка крові на ній сорбовані моноклональні антитіла до НВзАз ВГВ, кон'юговані з колоїдним золотом. На ній же в місці, позначеному Т (тест), жорстко фіксовані у вигляді смуги поліклональні антитіла до HBsAg та далі по мембрані у зоні К імобілізовані імунні компоненти для проявлення контрольної смуги (смуги безбарвні до початку дослідження).

Після внесення у певну позначену "S" зону нітроцелюлозної мембрани досліджуваного зразка, він змочує мембрану, внаслідок чого відбувається дифузія HBsAg (якщо він є у зразку) та кон'югованих з КЗ (барвником) специфічних антитіл уздовж мембрани до тестової смуги і далі. У процесі переміщення уздовж мембрани ці компоненти можуть специфічно взаємодіяти між собою та продовжують рух у направленні зони Т. Саме у місці розташування тестової смуги Т знов відбувається специфічна імунологічна взаємодія HBsAg або комплексу НBsAg - моноклональні антитіла, мічені КЗ тепер вже з поліклональними анти- НBs антитілами, що сорбовані на мембрані, з утворенням своєрідного бутерброду і накопиченням барвника. В результаті такої взаємодії з'являється смуга червоного кольору.

Подальша дифузія залишків кон'югату до зони К призводить до певної імунологічної взаємодії з утворенням контрольної червоної смуги, яка є свідченням правильно проведеного аналізу досліджуваного зразка.

Тлумачення результатів:

- тест позитивний - поява двох чітких ліній червоного кольору. Одна лінія повинна проявитися в зоні тесту Т, а інша - зоні контролю К. Позитивний результат означає наявність HBsAg в досліджуваному зразку крові.

Яскравість смуги у зоні Т може змінюватись в залежності від концентрації антигену у зразку. Тому поява смуги будь-якої яскравості і відтінку червоного кольору у зоні Т повинна розглядатись як позитивний результат.

- Тест негативний: тільки одна червона смуга з'являється у зоні контролю (К). Смуги в зоні тесту (Т) немає. Негативний результат свідчить про відсутність HBsAg у досліджуваному зразку крові.

- Тест недійсний: контрольна смуга не проявляється. Була використана недостатня за об'ємом кількість зразка або невірно здійснена процедура тесту. Потрібно повторити тест, використовуючи іншу нову тест-касету. Якщо проблема залишається, необхідно припинити дослідження та зв'язатись з місцевим дистриб'ютором.

Розроблений і готовий до застосування в Україні новий цито-тест для виявлення HBsAg - ультра-тест для дослідження сироватки або плазми крові. Принципова схема його також сама, проте, чутливість цього тесту сягає 0,5нг/мл.

За такою ж принциповою схемою твердофазного ІХА розроблений швидкий тест для експресного визначення HBsAg, який є розчинною формою корівського білку ВГВ, і, на відміну від нього, виявляється у біологічних рідинах інфікованої людини. Визначення HBeAg свідчить про активну репродукцію ВГВ в організмі пацієнта, тому його називають антигеном інфекційності.

Тлумачення результатів. Позитивний результат - поява двох червоних смуг - однієї у зоні тесту Т, другої у зоні контролю К, - свідчить про наявність HBeAg у досліджуваному зразку крові.

Негативний результат - поява тільки однієї червоної смуги у зоні контролю К свідчить про відсутність HBeAg у досліджуваній сироватці або плазмі крові, а також про те, що дослідження відбулося коректно.

Результат визначається, як недійсний, при відсутності забарвлених смуг у зонах Т та К. Можливо, процедура дослідження була здійснена з помилкою, або була внесена недостатня кількість реагентів.

Деякі швидкі тести, дозволяють ефективно діагностувати гепатит В шляхом виявлення в цільній крові (достатньо 0,1мл) HBsAg та HBeAg одночасно.

Такий швидкий Тест може являти собою прямокутну "книжечку" розміром 7,5 х 6,0 (см).

Принцип методу та хід дослідження. На дослідній нітроцелюлозній мембрані (на лівому боці розкритої книжечки) в верхній її частині адсорбовані антитіла до HBsAg, HBeAg та контрольні імуноглобулінові комплекси, мічені колоїдним золотом. До них дифундують вказані антигени ВГВ, якщо вони обидва є в досліджуваній краплі крові, котра наноситься на нижню частину тої ж мембрани. Утворюються мічені золотом комплекси HBsAg-анти-HBs, та HBeAg-анти-HBe.

На правому боці розкритої книжечки розміщена тестова нітроцелюлозна мембрана (НЦМ), в строму якої імпрегновані три невидимі поперечні смуги, що містять: верхня - антитіла до контрольних імуноглобулінових комплексів, середня - антитіла до HBeAg, нижня - антитіла до HBsAg. Після закривання книжечки контрольні та утворені специфічні комплекси (якщо вони є) дифундують в тестову НЦМ та зв'язуються відповідно з вищезгаданими антитілами в ній, формуючи забарвлені в темно-рожевий колір чіткі смуги.

Ці смуги реєструють візуально у відкритому віконці книжечки.

Для досліду використовують венозну або капілярну кров, останню відбирають каліброваним капіляром (є в тест-системі) в об'ємі 0,1 мл після проколу пальця. Капілярну кров треба використати для тесту негайно, венозну можна зберігати до трьох днів при температурі від 4 до 8 град. С.

Тривалість дослідження - 3 хвилини до появи забарвлених смуг. У випадку негативного результату чекають 15 хвилин.

Швидкий тест для визначення антитіл до розчинного HBeAg (анти-HBe) базується на імунохроматографічній взаємодії рекомбінантного HBeAg, міченого колоїдним золотом з антитілами досліджуваної сироватки (плазми) крові, а також на імунній взаємодії їх комплексу з іншими відповідними компонентами, жорстко іммобілізованими у зонах Т та К. Проявом такої взаємодії є утворення смуг червоного кольору.

Тлумачення результатів ІХА для визначення анти-HBe:

- позитивний аналіз - поява двох чітких червоних смуг - у зоні тесту Т та у зоні контролю К свідчить про наявність антитіл до анти-HBe у досліджуваному зразку крові;

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К, які свідчать про відсутність анти-НВе антитіл у досліджуваному зразку крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

В Україні зареєстрований Cito-тест для виявлення антитіл до серцевинного (корівського) антигену ВГВ - анти-HBc у сироватці або плазмі крові.

Принцип тесту. Дослідження анти-НВе IgG базується на конкурентному ІХА-аналізі. Хроматографічна мембрана для визначення анти-HBc до ВГВ має у своїй стромі декілька компонентів: у зоні внесення досліджуваного зразка крові на ній сорбований рекомбінантний HBcAg, кон'югований з колоїдним золотом. На ній же в зоні Т (тест) жорстко фіксовані у вигляді смуги поліклональні антитіла до HBcAg, та далі по мембрані у зоні К імобілізовані контрольні імунні компоненти ІХА. Після внесення у зону S нітроцелюлозної мембрани досліджуваного зразка, він змочує мембрану, внаслідок чого відбувається дифузія специфічних антитіл до НВс-антигену (якщо вони є у зразку) та кон'югованого з КЗ (барвником) HBcAg уздовж мембрани до тестової смуги і далі. У процесі переміщення уздовж мембрани ці компоненти специфічно взаємодіють між собою з утворенням комплексу антиген-антитіло, при цьому антигенні детермінанти HBcAg зв'язані поліклональними постінфекційними антитілами досліджуваної сироватки. При досягненні зони Т імунні комплекси анти-HBc - HBcAg-КЗ не взаємодіють з поліклональними антитілами тої ж специфічності, що жорстко сорбовані у зоні Т, бо HBcAg вже конкурентно заблокований сироватковими анти-HBc. Як наслідок, у місці розташування тестової зони барвник не накопичується і смуга червоного кольору не проявляється. Подальша дифузія вищезгаданих імунних комплексів або, при відсутності анти-HBc у зразку, кон'югату HBcAg з КЗ до зони К призводить утворенням контрольної червоної смуги, яка є свідченням правильно проведеного аналізу досліджуваного зразка.

Тлумачення результатів конкурентного ІХА для визначення анти-HBc IgG;

- позитивний аналіз - поява однієї червоної смуги у зоні контролю К і відсутність червоної смуги у зоні тесту Т свідчить про наявність антитіл до корівського антигену ВГВ у досліджуваній сироватці крові;

- слабко позитивний аналіз - на додаток до смуги червоного кольору у зоні контролю К з'являється тьмяна лінія рожевого кольору у зоні тесту Т, що є свідченням про наявність незначної кількості антитіл у досліджуваній сироватці;

- негативний аналіз - поява двох чітких забарвлених смуг у зонах тесту Т та контролю К, які свідчать про відсутність анти-НВс у досліджуваній сироватці/плазмі крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

Лікарям запропонований і комбінований Cito-тест, за допомогою якого можна одночасно виявити основні маркери гепатиту В: HBsAg/HBsAb, HBeAg/HBeAb, HBcAb.

Cito-тест є абсолютно необхідним і доцільним в інфектології. Так, визначення HBsAb є необхідним для етіологічної діагностики гострого або хронічного гепатиту В. Дослідження анти-HBs доцільно проводити для контролю рівня поствакцинального імунітету після застосування профілактичної вакцинації проти гепатиту В. Велике прогностичне значення у діагностиці гепатиту В має виявлення пари маркерів: HBeAg та анти-HBe антитіл. Якщо останні з'являються у пацієнта після зникнення HBeAg (через 3-5 тижнів від початку захворювання), така сероконверсія свідчить про формування гострої продуктивної інфекції, котра закінчиться повним одужанням. Пролонговане у часі визначення HBeAg і відсутність анти-HBe може оцінюватись як формування хронічного гепатиту В. Наявність анти-HBc є свідченням хронічного або перенесеного у минулому гострого продуктивного гепатиту В. Виходячи з цього, такий маркер інфекції, як анти-HBc антитіла, може бути показником до вакцинації проти гепатиту В: відсутність анти-HBc свідчить про необхідність вакцинації, і навпаки.

Комплексне визначення всіх маркерів одночасно у динаміці гострого гепатиту В складає повну картину клінічного перебігу гепатиту В і його прогноз.

Остаточний діагноз гепатиту В не може бути встановлений тільки за результатами швидких тестів, але обов'язково після співставлення результатів тестів з клінічними та іншими лабораторними методами дослідження. Між тим негативний результат ІХА на гепатит В є достовірним.

2.2. ВІРУСНИЙ ГЕПАТИТ С.

Гепатит С є проблемою не тільки інфектології, вона актуальна для лікарів гастроентерологів, терапевтів, онкологів. Гепатит С називають "лагідним" вбивцею, маючи на увазі переважно легкий перебіг хвороби у гострій стадії, але в подальшому відбувається хронізація інфекційного процесу у 80% осіб. В основі хронізації лежить безпрецедентна мінливість збудника у квазіваріантах, яку не може зупинити й подолати імунна система хворої людини. Наслідком хронізації гепатиту С є розвиток цирозу печінки та гепатоцелюлярної карциноми у значної кількості хворих. В світі (за оціночними даними різних експертів) зареєстровано від 150 до 500 млн. хворих на гепатит С, в Україні така реєстрація розпочалася лише з 2003 р. Як і гепатит В, гепатит С передається парентеральним шляхом, існують групи людей з підвищеним ризиком зараження цією інфекцією. Серед них, на першому місці ін'єкційні споживачі наркотиків, ВІЛ-інфіковані, реципієнти крові та органів, хворі, що знаходяться на гемодіалізі тощо. До групи такого ризику відносять і медичних працівників, особливо хірургічних та стоматологічних спеціальностей.

Швидкі тести будуть безумовно корисними для екстреної етіологічної діагностики гепатиту С в умовах виникнення аварійної ситуації під час надання медичної допомоги хворому, інфікованому ВГС.

Така діагностика допоможе, у разі потреби, своєчасно застосувати специфічну комплексну антивірусну терапію, і зменшити ризик хронізації гепатиту С з подальшою згаданою небезпечною еволюцією хронічного гепатиту С. Швидкі тести для етіологічної діагностики гепатиту С знайдуть свою нішу застосування у практиці дільничного терапевта, педіатра та сімейного лікаря територіально віддалених лікувально-профілактичних закладів охорони здоров'я України.

За допомогою швидких тестів визначають антитіла до ВГС у суцільній крові, її сироватці та плазмі.

Принцип тесту. Виявлення анти-HCV -антитіл базується на застосуванні в ІХА-аналізі імунологічної взаємодії рекомбінантного антигену ВГС, що жорстко сорбований на нітроцелюлозній мембрані, з анти-HCV досліджуваного зразка. Хроматографічна мембрана для визначення анти-HCV має у своїй стромі такі компоненти: у зоні внесення досліджуваного зразка крові на ній нанесений білок А золотавого стафілококу (штам Cowan), який має здатність вибірково зв'язуватись з С-фрагментом імуноглобулінів, тобто, антитіл. Білок А кон'югований з барвником - колоїдним золотом. На ній же в зоні Т (тест), жорстко фіксований у вигляді смуги рекомбінантний HCVAg, та далі на мембрані у зоні К (контроль) іммобілізовані відповідні імунні компоненти ІХА. При нанесенні досліджуваного зразка на мембрану він змочує її, внаслідок чого відбувається дифузія анти-HCV (при їх наявності в зразку) і міченого КЗ протеїна А. Анти-HCV IgG зв'язуються своїм С-фрагментом з протеїном А, міченим барвником, і утворені комплекси антитіл з барвником, хроматографічно просовуючись уздовж мембрани, досягають місця розташування HCVAg у зоні Т. Імунологічна взаємодія комплексу анти-HCV IgG-білок А-КЗ з антигеном призводить до формування специфічних імунних комплексів і накопичування барвника та появи смуги червоного кольору. Подальша дифузія вищезгаданих імунних комплексів або, при відсутності анти-HCV у зразку, кон'югату білка А з КЗ до зони К призводить до певної імунологічної взаємодії їх з контрольними компонентами з утворенням контрольної червоної смуги, яка є свідченням правильно проведеного аналізу досліджуваного зразка.

Тлумачення результатів конкурентного ІХА для визначення антитіл до HCV:

- позитивний аналіз - поява двох чітких червоних смуг - у зоні тесту Т та у зоні контролю К свідчить про наявність антитіл до вірусу гепатиту С у досліджуваному зразку крові;

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К, які свідчать про відсутність анти-HCV у досліджуваному зразку крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

Остаточний діагноз гепатиту С не може бути встановлений тільки за результатами швидких тестів, але обов'язково після аналізу сукупних результатів тестів з клінічними та іншими лабораторними методами дослідження. Між тим негативний результат на гепатит С є достовірним.

2.3. ВІЛ-ІНФЕКЦІЯ/СНІД

ВІЛ-інфекція/СНІД набула в Україні загрозливого епідемічного поширення. За останніми оціночними даними експертів ВООЗ більше 1% населення країни вже є ВІЛ-інфікованими. У глобальному масштабі ВІЛ-інфекція/СНІД вийшла на четверте місце серед причин смертності.

ВІЛ-інфекція є захворюванням з природними (статевий та від матері до дитини) та штучним парентеральним шляхами передачі збудника. В структурі груп ризику підвищеної захворюваності на ВІЛ-інфекцію більше 60% займають ін'єкційні споживачі наркотичних речовин, росте відсоток інфікованих ними статевим шляхом їх сексуальних партнерів, насамперед, жінок, і, як наслідок, збільшується відсоток ВІЛ-інфікованих новонароджених дітей. В цьому плані ВІЛ/СНІД загрожує існуванню нації. Нагляд за поширенням ВІЛ-інфекції в Україні здійснюється шляхом лабораторного обстеження певних груп населення. Свою нішу тут знаходять і швидкі тести для лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції/СНІДу.

Принцип тесту. Виявлення антитіл до збудників імунодефіциту 1-го і 2-го типів (ВІЛ1/2) - базується на застосуванні в ІХА-аналізі імунологічної взаємодії рекомбінантних антигенів ВІЛ1/2, що жорстко {мобілізовані на нітроцелюлозній мембрані, з анти- ВІЛ1/2 досліджуваного зразка.

Хроматографічна мембрана для визначення анти- ВІЛ1/2 має у своїй стромі наступні компоненти: у зоні внесення досліджуваного зразка крові на ній нанесені рекомбінантні антигени вірусів імунодефіциту людини 1 і 2 типів, які кон'юговані з барвником - колоїдним золотом. На ній же в зоні Т (тест) жорстко фіксовані у вигляді смуги (до аналізу безбарвної) рекомбінантні антигени ВІЛ1/2, та далі на мембрані у зоні К іммобілізовані контрольні імунні компоненти. Після внесення досліджуваного зразка крові, який змочує мембрану, відбувається дифузія анти- ВІЛ1/2 (при наявності в зразку) та антигенів ВІЛ, мічених барвником. Протягом дифузії вони взаємодіють один з одним, утворюючи імунні комплекси ВІЛ1/2Ag - анти ВІЛ1/2, хроматографічно просовуються далі уздовж мембрани, досягають місця розташування ВІЛAg1/2 мембрані у зоні Т і знову імунологічне взаємодіють з останніми, що призводить до формування специфічних імунних комплексів і накопичування барвника. У зоні Т з'являється чітка смуга червоного кольору. Подальша дифузія вищезгаданих імунних комплексів або, при відсутності анти- ВІЛ1/2 у зразку, кон'югату ВІЛ1/2Ag з КЗ до зони контролю К призводить до утворення контрольної червоної смуги, яка є свідченням правильно проведеного аналізу досліджуваного зразка.

- Тлумачення результатів ІХА для визначення антитіл до ВІЛ1/2Ag:

- позитивний аналіз - поява двох чітких червоних смуг - у зоні тесту Т та у зоні контролю К свідчить про наявність антитіл до анти- ВІЛ1/2 у досліджуваному зразку крові;

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К, які свідчать про відсутність анти- ВІЛ1/2 у досліджуваному зразку крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

Остаточний діагноз ВІЛ-інфекції не може бути встановлений тільки за результатами швидких тестів, але обов'язково після аналізу сукупних результатів тестів з клінічними та іншими (ІФА, ПЛР) лабораторними методами дослідження.

2.4. ГРИП

Враховуючи факт надзвичайної поширеності грипу та більш, ніж двадцятивідсоткове ураження населення щороку, проблема лабораторної діагностики грипу є значною. Необхідність коректного та швидкого встановлення діагнозу грипу постає при проведенні диференційної діагностики, особливо у дітей та в тяжких випадках, а також перед призначенням етіотропної протигрипозної терапії специфічними протигрипозними хіміопрепаратами.

Крім того, на сьогоднішній день світ опинився на порозі виникнення нової пандемії грипу, що буде викликана принципово новим для людини зміненим антигенним варіантом вірусу грипу А, вірогідно, пташиного походження. Для підготовки до майбутньої пандемії за завданням ВООЗ були створені швидкі тести на грип.

Для лабораторної діагностики грипу загально уживаними є класичні методи . Таких налічується декілька, причому кожен з них має свої позитивні сторони та свої недоліки, а саме:

1. Виділення вірусу від хворого на курячих ембріонах або на культурі перещеплюваних клітин МОСК. У разі виділення вірусу - це є абсолютно точним підтвердженням грипу у хворої людини. Однак, метод потребує часу - від 2 діб і більше. Крім того, далеко не у всіх випадках вдається виділити вірус від хворого.

2. Експрес-метод діагностики - імунофлуоресцентний метод визначення антигену грипу у відбитках з носу з використанням флуоресціюючих антитіл. Метод дозволяє швидко встановити діагноз "грип", але має обмежену точність і потребує спеціального обладнання (люмінесцентного мікроскопу), а для його виконання - висококваліфікованого спеціаліста не менш, ніж з дворічним досвідом роботи цим методом.

3. Серологічний метод - визначення антитіл до вірусів грипу у парних сироватках крові хворих, відібраних з інтервалом у 10-14 днів. Метод досить точний, але використовується лише для ретроспективної діагностики.

4. Імуноферментний метод - точність методу достатня, але виконання його потребує крім тест-систем ще й спеціального обладнання.

Використання швидких тестів на грип А та В дозволяє швидко і досить точно встановити діагноз "грип", не відходячи від ліжка хворого. Чутливість та специфічність тесту - 95 %.

Принцип тесту. Швидкий тест на грип А та В є імунохроматографічним тестом для якісного визначення антигенів вірусу грипу А та В (нуклеопротеїнів) у носо-горлянкових змивах від хворих. Завдяки наявності на тест-касеті двох окремих мембран, він дозволяє визначити присутність антигену вірусу грипу А або В. Під час проведення дослідження носо-горлянковий змив додається у лунку тест-касети. Під дією капілярної сили рідина просувається вздовж мембран. Якщо у досліджуваному зразку присутній антиген вірусу грипу А чи В, він зв'язується кон'югованими антитілами до вірусу грипу анти-А або анти-В. При цьому утворюється смуга, яку видно, як результат формування імунного комплексу антитіло-антиген-антитіло, що покрите кольоровими частками у тест-зоні (Т). Антитіла, покриті кольоровими частками, не зв'язані у тест-зоні, захоплюються в контрольній зоні (К) козячими протимишиними антитілами. Візуально лінія у контрольній зоні завжди має з'являтися для підтвердження, що тест виконано коректно.

Тлумачення результатів:

- позитивний аналіз - поява двох чітких смуг. Якщо антиген вірусу грипу А або В у зразку присутній, то у відповідному вікні з'являється чорна смуга у тест-зоні (Т) і одна - у контрольній зоні (К).

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К. Якщо антиген вірусу грипу відсутній, з'являється лише одна чорна смуга у контрольній зоні (К).

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К Якщо не з'явилася чорна смуга у контрольній зоні, тест може бути зіпсований або при дослідженні додано недостатню кількість зразка. Тест слід повторити.

LIKAR.INFO по матерiалах МОЗ України