Додаток 1
ЗАТВЕРДЖЕНО
наказом МОЗ України
23.09.2004 № 467

В основу оцінки принципів та методів мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб, як відомо, положені наступні критерії:

- Достовірність принципу, методу, тобто їх надійність для точної постановки діагнозу;

- Безпечність принципу, методу для хворого, лікаря, оточуючих;

- Доступність принципу, методу для широкого використання у практиці, тобто його простота;

- Принцип, метод повинні бути ранніми, тобто дозволяти ставити діагноз інфекційного захворювання якомога раніше.

Саме дотримуючись цих підходів ми будемо висвітлювати розділ, присвячений швидкій діагностиці інфекцій, викликаних бактеріями.

3.1. Сифіліс.

Щороку в світі реєструється близько 12 млн. свіжих випадків сифілісу. Нині в багатьох країнах світу відзначається стабілізація або навіть зниження рівня захворюваності на сифіліс, однак це не стосується України. Сучасний етап розвитку проблеми сифілісу в Україні характеризується не тільки високим рівнем захворюваності, але й тим, що в переважній кількості випадків спостерігаються скриті форми та нетипові прояви захворювання, резистентність до хіміотерапії. Основними факторами, що вплинули на зростання захворюваності є вживання наркотичних речовин, висока поширеність проституції серед молоді, незахищені статеві контакти, епідемія ВІЛ-інфекції/СНІДу та алкоголізм.

Дослідження крові донорів на маркери сифілісу є обов'язковим заходом сьогодні для служби крові в багатьох країнах світу. Серологічна діагностика сифілісу є провідною та найбільш доступною. Широко застосовуються реакція Вассермана і КРК (rapid plasma reagin) тест, кардіоліпіновий тест, реакції гемаглютинації (РГА) та мікропреципітації, реакція іммобілізації трепонем (Treponema pallidum), імунофлуоресценції та ІФА.

Нещодавно була введена в лабораторну практику швидка діагностика сифілісу на імунохроматографічній смузі або у форматі латерального потоку. Для дослідження відбирається кров з пальця або з вени, час проведення - небільше 10-15 хвилин. Хроматографічні експрес-тести призначені для якісного визначення специфічних антитіл до збудника сифілісу (антитрепонемних антитіл класу IgG) в цільній крові, сироватці або плазмі крові.

Принцип тесту. Ці швидкі тести базуються на принципі взаємодії мікрочастинок, вкритих АГ Treponema pallidum з імуноглобуліном людини класу IgG. Антитіла до IgG зафіксовані в районі тест-смуги Т на тест-касеті. Після додання у лунку S на касеті зразка крові (або плазми чи сироватки крові), останній реагує з мікрочастинками, вкритими АГ Treponema pallidum на мембрані. Суміш хроматографічно просувається вздовж мембрани під дією капілярних сил, реагує з АТ класу IgG, що зафіксовані в районі смуги Т на тест-касеті. Якщо зразок містить в собі АТ до Treponema pallidum, то з'являється забарвлена смуга. Наявність чіткої забарвленої смуги в тестовій зоні свідчить про позитивну реакцію, в той час як її відсутність - про негативну реакцію. Як і в попередніх випадках, що ми вже описували для інших хроматографічних тестів, в якості вбудованої внутрішньої системи контролю, кольорова смуга завжди повинна з'являтись в зоні контролю К, тим самим підтверджуючи, що відбулося капілярне затікання.

Аналіз отриманих результатів:

- позитивний аналіз - поява двох чітких червоних смуг - у зоні тесту Т та у зоні контролю К свідчить про наявність антитрепонемних АТ у досліджуваному зразку крові;

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К, які свідчать про відсутність антитрепонемних АТ у досліджуваному зразку крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

Обмеження до застосування імуногрофатографічних експрес-тестів для виявлення сифілісу:

- Експрес-тест для визначення сифілісу (цільна кров/плазма/сироватка) призначений для діагностики в умовах ін вітро. Тест повинен використовуватися для визначення АТ ТР у клінічних зразках: цільна кров/плазма/сироватка крові. Він є якісним і тому не може визначати кількісний вміст хламідій або рівень вмісту ТР.

- Даний тест тільки вказує на наявність АГ ТР у зразку та не повинен бути єдиним критерієм для визначення та постановки діагнозу інфекції, спричиненої ТР.

- Як і в усіх випадках діагностики, результати тесту повинні розглядатися у сукупності з усією клінічною інформацією.

- Отриманий негативний результат не виключає можливості присутності інфекції ТР.

Чутливість та специфічність - є дуже важливими і основними показниками якості експрес-тестів, які завжди треба враховувати при виборі будь-якого тесту. Чутливість - це здатність виявляти мінімальну кількість того компоненту (АГ або АТ), для визначення якого і призначена тест-система. Низька чутливість обумовлює формування хибнонегативних результатів. Специфічність визначає здатність тест-системи диференційовано виявляти саме той компонент, для визначення якого і призначена тест-система. Низька специфічність призводить до отримання хибнопозитивних результатів. Загально відомо, що чим вищі ці показники для тестів, тим якісніші ці тести. За результатами порівняння з показниками сероковерсійної панелі та з показниками провідного тесту на сифіліс FTA-ABS чутливість одноступеневого експрес-тесту сягає 99,6%. Визначена специфічність складає 99,1%.

3.2. ХЛАМІДІОЗ.

Урогенітальний хламідіоз (УХ) є одним із найпоширенніших захворювань, що передаються статевим шляхом. За даними ВООЗ у світі УХ хворіє близько 80 млн. чоловік. Тільки США щорічно реєструється близько 5 млн нових випадків УХ, а в Європі до 10 млн. випадків на рік. В Російській Федерації спостерігається стійка тенденція до росту захворюваності на УХ, при цьому показник захворюваності складає 106,1 на 100 тис. населення.

Використання сучасних методів діагностики дозволяє виявити хламідійну інфекцію у кожної другої жінки з хронічними захворюваннями урогенітальної системи. Велику роль хламідійні інфекції відіграють в розвитку передракових захворювань шийки матки. У 50% жінок, що страждають безпліддям, причиною останнього є УХ. За даними світової літератури, при безплідних браках 50-55% чоловіків є стерильними, з них у 64% Чстерильність обумовлена хламідійною урогенітальною інфекцією.

Збудниками хламідійних інфекцій є грамнегативні бактерії, облігатні внутрішньоклітинні паразити з унікальним циклом розвитку, який включає дві різні за розміром, морфологічними ознаками і формою існування стадії - дрібні елементарні інфекційні тільця і великі ретикулярні неінфекційні внутрішньоклітинні. Цикл розвитку хламідій продовжується протягом 48-72 год. Протягом цього часу ретикулярні тільця перетворюються на елементарні, які виходять у зовнішнє середовище і заражають інші клітини. При деяких умовах хламідії можуть зупинити свій цикл розвитку і зберігатись у клітинах в неактивному стані, але життєздатними, з утворенням, так званих, "атипових" персистуючих форм, які при сприятливих умовах можуть знову реверсувати в інфекційні форми.

Рід хламідій об'єднує чотири види (C. trachomatis, C. pneumoniae, C. Psittaci, C. pekorum), з яких найбільше значення для людини мають перші два, вони ж мають один загальний антиген. Клінічні прояви хламідійних інфекцій різноманітні і залежать від вірулентності збудника, тривалості його перебування в організмі та напруженості загального і місцевого імунітету людини. Найчастіше виявляється УХ інфекція, яка починається, як правило, розвитком первинного вогнища на слизовій оболонці цервікального каналу. З первинного вогнища збудник може розповсюджуватись по всіх відділах статевих шляхів жінки, викликаючи розвиток бартолініту, ендометриту, сальпінгіту, запалення органів малого тазу, тощо. Усі ці захворювання найчастіше мають безсимптомний перебіг (син.: або "асимптоматичний"), який здебільшого характеризується незначним болем у низу живота, зудом зовнішніх статевих органів. Асимптоматичними є 70% ендоцервікальних інфекцій у жінок і, що дуже важливо, етіологічний діагноз такого захворювання визначається тільки при лабораторному обстеженні.

Діагностика хламідіозів докладно описана в численних методичних рекомендаціях. До вже представлених в цих матеріалах даних можна добавити, що в останні роки широкого застосування набули високочутливі, але дуже дорогі методи, такі як ПЛР, лігазна ланцюгова реакція, сендвіч-гібридизація та інші. Не втратили своєї актуальності методи світлової мікроскопії зішкрябних препаратів слизової оболонки кон'юнктиви, сечостатевих органів, пофарбованих за Романовським-Гімзою і імунофлуоресцентної мікроскопії із застосуванням флуоресціюючих полі- і моноклональних сироваток. Певної популярності набув експрес-тест - ферментативна система для визначення С. trachomatis безпосередньо на тампоні (за зміною кольору). Проте особливу зацікавленість лікарі виявляють до швидких імунохроматографічні експрес-тестів для якісного визначення загального антигену С. trachomatis у мазках, зібраних у жінок з цервікального каналу, у мазках, зібраних з уретри у чоловіків та зразках чоловічої сечі з метою діагностики хламідійної інфекції.

При застосуванні цих тестів результат готовий вже через 10 хвилин.

Обмеження до застосування імуногрофатографічних експрес-тестів для якісного визначення АГ С. trachomatis:

- Експрес-тест для визначення антигена Хламідії (Мазок/сеча) призначений для діагностики в умовах ін вітро. Тест повинен використовуватися для визначення АГ хламідії у клінічних зразках. Він є якісним і тому не може визначати кількісний вміст хламідій або рівень вмісту АГ хламідії.

- Даний тест вказує на наявність АГ хламідії у зразку у життєздатному або не життєздатному стані.

- Кількість мікроорганізмів у зразку для дослідження впливає на визначення хламідії. Це обумовлено технічною стороною забору матеріалу (зразку) та такими факторами, як вік пацієнта, наявність в анамнезі захворювань, що передаються статевим шляхом, наявними симптомами, тощо. Як і в усіх випадках діагностики, результати тесту повинні розглядатися у сукупності з усією клінічною інформацією.

- Неможливо виявити ступінь ефективності проведеної антимікробної терапії, так як АГ може бути присутнім і після її проведення.

В роботі швидкі тести на хламідію (Мазок/сеча) виявляють достатньо високу чутливість і специфічність - для зразків чоловічої сечі 81,5% і 91,3% відповідно; для зразків, зібраних зондом з чоловічої уретри - 86,7% і 92,9% відповідно; для зразків, зібраних зондом із цервікального каналу - 93,3% і 97,7% відповідно.

Тлумачення результатів:

- Позитивний аналіз - поява двох чітких червоних смуг - у зоні тесту Т та у зоні контролю К свідчить про наявність АГ хламідії у досліджуваному зразку крові;

_______________

* Увага: Яскравість смуги в зоні (Т) може бути різна в залежності від концентрації АГ хламідії у досліджуваному зразку. Ось чому, поява смуги будь-якого відтінку червоного в зоні (Т) має бути розцінена як позитивний результат.

- негативний аналіз - поява однієї забарвленої смуги у зоні контролю К свідчать про відсутність АГ хламідії у досліджуваному зразку крові;

- недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К свідчить про зроблену процедурну помилку або про внесення недостатньої кількості реагентів. Аналіз треба повторити з новою тест-системою.

3.3. ТУБЕРКУЛЬОЗ.

Згідно з світовою статистикою щороку в усьому світі від туберкульозу гине понад 2 мільйони людей - це більше, ніж за весь час історії людства (WHO, Fact Sheet № 104 Revised April 2000). За оцінками ВООЗ в період між 2000 і 2020 роками, майже 1 мільярд осіб буде інфіковано, 200 мільйонів - захворіє та 35 мільйонів загине від туберкульозу, якщо контроль за епідемією не буде посилено. Сьогодні в Україні понад 125 тисяч хворих активною формою туберкульозу. Щорічно понад 12 тисяч українських громадян помирають від цієї хвороби, що складає більше 30 людей на день. В 2003 році рівень захворюваності на туберкульоз становив 77,5 на 100 тис. населення, а рівень смертності - 21,8 на 100 тис. В 2004 році відзначається 11-та річниця від того часу, коли ВООЗ проголосила туберкульоз глобальною небезпекою.

Збудником туберкульозу є патогенні мікобактерії роду Mycobacterium родини Mycobactеriaceae. Цей рід об'єднує понад 30 видів мікобактерій, але туберкульоз у людини спричиняють лише 2 - Mycobacterium tuberculosis та Mycobacterium bovis. Найбільше епідемічне значення має людський вид - мікобактерія туберкульозу (МБТ).Встановлено, що 95-98 % штамів, що їх виявляють у хворих на туберкульоз органів дихання, припадає на цей вид. Крім безумовно патогенних для людини МБТ, певну роль у виникненні захворювань, що за клінічним перебігом нагадують туберкульоз, відіграють умовно-патогенні атипові мікобактерії. Вони спричиняють мікобактеріози, які на окремих територіях становлять 3% захворювань, зумовлених мікобактеріями, головним чином поза легеневої локалізації.

Діагноз туберкульозу встановлюють на підставі результатів клінічного, рентгенологічного обстеження, а також лабораторного дослідження. Є такі лабораторні методи, що дають змогу отримати безпосереднє підтвердження інфекції. До них належать бактеріологічні (бактеріоскопія, різні способи флотації, культуральні методи із застосуванням спеціальних середовищ), морфологічні та деякі інші. В сучасну лабораторну діагностику туберкульозу залучаються і такі нові методи, як ІФА, ПЛР, радіометричний метод ВАСТЕС, молекулярно-біологічні дослідження рестрикційних фрагментів ДНК мікобактерій тощо. Останні вимагають використання лабораторій із найсучаснішим дуже дорогим обладнанням та тест-системами, а також висококваліфікованих співробітників, здатних якісно та правильно проводити такі дослідження.

Діагностика туберкульозу різних форм має свою особливість. Треба враховувати також, що при низькій чутливості бактеріологічних методів, наприклад, бактеріоскопії (30-80%) та тривалості до кількох тижнів культурального методу, при вкрай високих затратах на молекулярно-біологічні методи, актуальним стає розробка та впровадження в практику дешевих методів індикації МБТ та серодіагностики туберкульозу.

Швидкі імунохроматографічні тести для виявлення специфічних антитіл до антигенів Mycobacterium tuberculosis призначені для дослідження сироватки крові, плазми та цільної крові. Вони зареєстровані в Україні, прості у виконанні і доступні. Швидкі ІХА-тести для серодіагностики виявляють специфічні антитіла класів IgG та IgA до МБТ. У випадку високих концентрацій в крові виявляються також IgM. При цьому, дуже важливо підкреслити, що зразки, отримані від осіб, вакцинованих БЦЖ не виявляються цим тестом.

Швидкі тести є безумовно корисними в діагностиці активного туберкульозу.

Принцип тесту. Виявлення антитіл до протеїнів МБТ - базується на застосуванні в ІХА-аналізі імунологічної взаємодії синтетичних антигенів МБТ, що жорстко іммобілізовані на нітроцелюлозній мембрані, з комплексом антиМБТ з антилюдським IgG, кон'югованим з КЗ. Хроматографічна мембрана для визначення антиМБТ має у своїй стромі наступні компоненти: у зоні внесення досліджуваного зразка крові (або сироватки крові, або плазми ) на ній нанесені антилюдський IgG, кон'югований з барвником - колоїдним золотом (КЗ). На цій же мембрані в зоні Т (тест) жорстко фіксовані у вигляді смуги (до аналізу безбарвної на вигляд) антигени МБТ, та далі на мембрані - зона К (контроль).

Після внесення досліджуваного зразка крові, плазми або сироватки крові, відбувається дифузія антиМБТ (при наявності в зразку) та антилюдських імуноглобулінів, мічених барвником. Протягом дифузії вони взаємодіють один з одним, утворюючи імунні комплекси, хроматографічно просовуються далі уздовж мембрани, досягають місця розташування протеїнів МБТ на мембрані і знову імунологічно взаємодіють з останніми, що призводить до формування специфічних імунних комплексів і накопичування барвника. В зоні Т з'являється чітка смуга червоного кольору. Подальша дифузія вищезгаданих імунних комплексів або, при відсутності антиМБТ у зразку, кон'югату з КЗ до зони контролю К призводить до імунологічної взаємодії їх з утворенням контрольної червоної смуги, яка є свідченням правильно проведеного аналізу досліджуваного зразка.

Тлумачення результатів здійснюють згідно з інструкцією, отримуючи відповідно позитивний (дві кольорові смуги в зонах Т і К), негативний (одна кольорова смуга в зоні К) або недійсний результат (жодної кольорової смуги на касеті тесту).

3.4. ГОНОРЕЯ.

Гонорея поширена в усьому світі. У нашій країні останнім часом захворюваність на гонорею має незначну тенденцію до зниження, але в окремих областях щорічно кількість хворих зростає. Особливу увагу привертає поширення гонореї серед дітей та підлітків.

Гонорея спричиняється гонококом - парним коком, відкритим у 1879 році А. Нейсером. З метою раннього і повного виявлення хворих для діагностики гонореї матеріал забирається з осередків можливого ураження (сечовивідного каналу, прямої кишки, каналу шийки матки). Як правило використовуються хоча б один метод дослідження: бактеріоскопічний, бактеріологічний, МФА, імунохімічний, серологічний або алергійний тест. Лабораторне обстеження доцільно організовувати не тільки в кабінетах дерматовенерологічного диспансеру, а і у базових жіночих консультаціях, оглядових кабінетах лікарень та амбулаторій державної та недержавної форм власності.

Як відбірковий тест під час обстеження великих груп населення, що підлягають обов'язковому медичному обстеженню на венеричні хвороби, та пацієнтів із хронічними запальними процесами сечових і статевих органів нез'ясованої етіології, а також і для поодиноких досліджень рекомендується застосовувати швидкий касетний тест для виявлення гонореї Cito Test Gonorrhoea.

Принцип тесту. Одностадійний касетний тест для діагностики гонореї є швидким і дозволяє візуально виявити антиген збудника в досліджуваних зразках. В тесті задіяно принцип імунного аналізу і застосовуються як моноклональні, так і поліклональні АТ. Чутливість та специфічність тесту значно перевищують відповідні бактеріологічні методи дослідження. Вживання будь-яких лікарських засобів не впливає на результат тесту, який здатний виявити як мінімум 1х105 бактерій/мл.

Тривалість 10-20 хвилин.

Увага! Не проводити облік результатів через 30 хвилин!

Тлумачення результатів здійснювати у повній відповідності до інструкції:

- Негативний аналіз: тільки одна смуга в зоні контролю (К).

- Позитивний аналіз: по одній рожевій смузі в зоні контролю (К) і в зоні тесту (Т).

- Недійсний аналіз - відсутність смуги у зоні контролю К.

Попередження:

- Призначений тільки для діагностики в умовах ін вітро.

- При роботі із зразками застосовувати латексні або гумові рукавички.

- Дотримуватися терміну придатності тесту.

- Не використовувати двічі.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

АГ антиген

АТ антитіло

АО аглютинуючі одиниці

НК нуклеїнова кислота

ДНК Дезоксирибонуклеїнова кислота

Ig імуноглобуліни (Ig A, Ig M, IgG)

ІФА імуноферментний аналіз

мкг/мл мікрограм на мілілітр

мл мілілітр

РЛА реакція латекс-аглютинації

РНГА реакція непрямої гемаглютинації

РНК рибонуклеїнова кислота

TP Treponema Pallidum

МБТ Мікобактерія туберкульозу

МФА метод флюоресціюючих антитіл

РІА радіоімунний аналіз

ПЛР полімеразна ланцюгова реакція

К контроль

КЗ колоїдне золото

ІХА імунохроматографічний аналіз

Додаток № 2

-----------------------------

|Код форми за ДКУД _________|

|Код закладу за ЄДРПОУ _____|

-------------------------------------+---------------------------|

| | |Медична документація |

| МОЗ України | |Форма № 498-1/0 |

|--------------------| |Затверджена наказом |

| | |МОЗ України |

|Найменування закладу| |23.09.2004 № 467 |

|----------------------------------------------------------------|

| |

| Журнал |

| протоколів проведення дослідження крові на антитіла |

| до інфекційних хвороб швидкими тестами |

| |

| |

|Почато "__" _________ р. Закінчено "__" _________ р.|

| |

| Для друкарні! |

| При виготовленні документа |

| використати формат А4 |

| (48 сторінок) |

------------------------------------------------------------------

Сторінка 2 ф. № 498-1/о

1. N протоколу

2. Дата проведення дослідження

3. Повна назва, серія, термін придатності швидкого тесту

------------------------------------------------------------------

|N п/п |Прізвище, ім'я|Назва |Результат |Прізвище, ім'я|

|зразка|та по батькові|відділення/|дослідження |та по батькові|

|крові |обстежуваного |підрозділу |крові (плазми, |виконавців |

| | |медичного |сироватки крові|тесту, підписи|

| | |закладу |(прописом) | |

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

|------+--------------+-----------+---------------+--------------|

------------------------------------------------------------------


Додаток З

ЗАТВЕРДЖЕНО

наказом МОЗ України

23.09.2004 № 467

ІНСТРУКЦІЯ

щодо заповнення форми "Журнал протоколів проведення дослідження крові на антитіла інфекційних хвороб швидкими тестами"

1. Форму № 498-1/о "Журнал протоколів проведення дослідження крові на антитіла до інфекційних хвороб швидкими тестами" заповнюють фахівці лікувально-профілактичних закладів, які здійснюють дослідження крові на інфекційні хвороби із застосуванням швидких тестів.

2. Журнал заповнюється на кожний випадок проведення дослідження зразка крові з використанням швидкого тесту.

3. У верхньому лівому куті форми вказується найменування закладу, фахівці якого здійснювали дослідження крові.

4. У пункті 1 зазначається порядковий номер протоколу дослідження на антитіла до інфекційних хвороб швидким тестом.

5. У пункті 2 словами зазначається дата проведення дослідження.

6. У пункті 3 вказується повна назва, серія та термін придатності швидкого тесту, який використовується для дослідження.

7. У графі 1 зазначається порядковий номер зразка крові.

8. У графі 2 зазначається прізвище, ім'я та по батькові обстежуваного (повністю).

9. У графі 3 вказується назва відділення або підрозділу лікувального закладу, який направив зразок крові на дослідження.

10. У графі 4 зазначається результат дослідження крові (плазми, сироватки крові) з використанням швидкого тесту обов'язково прописом "позитивний", "сумнівний" або "негативний".

11. У графі 5 вказується прізвище, ім'я, по батькові (повністю) фахівців, які проводили дослідження та здійснювали візуальну оцінку кінцевого результату, і їх підписи.

12. Протоколи досліджень зберігаються в архіві лабораторії протягом трьох років після закінчення журналу протоколів.

13. Термін зберігання форми № 498-1/о - 3 роки.

Директор Департаменту
організації медичної
допомоги населенню


М.П.Жданова

LIKAR.INFO по матерiалах МОЗ України