Г.А. Атажанова
АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия»,
г. Караганда, Республика Казахстан

Цель: разработка новых отечественных фитопрепаратов на основе эфирных масел природной флоры Казахстана.

Методы: для получения эфирных масел с последующим исследованием химического состава использовали метод гидродистилляции на аппарате Клевенджера в течение 3-х часов и метод паровой дистилляции в течение 3 часов на аппарате УЭМ опытного цеха фитопрепаратов АО «МНПХ «Фитохимия». Компонентный состав эфирных масел анализировали методом хромато-масс-спектрометрии на приборе Hewlett Packard GCD с квадрупольным детектором.

Биоскрининг полученных эфирных масел проведен:

  • в Научном центре ароматических и лекарственных растений и лекарств (ТВАМ Университета Анадолу) (г. Эскишехир, Турция) - антибактериальная активность эфирных масел 17 видов растений методом микроразведения грамположительных и грамотрицательных бактерий антимикробная, противогрибковая, цитотоксическая, анальгетическая активность 230 образцов в лаборатории биоскрининга МНПХ «Фитохимия»;
  • противотуберкулезная активность 12 образцов эфирных масел в Национальном центре биотехнологии РК;
  • противовирусная активность в НИИ проблем биологической безопасности (п.Отар, Республика Казахстан);
  • цитотоксическая активность эфирного масла полыни гладкой и полыни цитварной в Исследовательском Институте химии Университета Карачи (Пакистан);
  • противовирусная, цитотоксическая, интерферониндуцирующая активность эфирного масла аянии кустарничковой и 1,8-цинеола в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского (г. Москва). Изучение антимикробной активности вышеуказанных образцов проводилось по отношению к штаммам грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus agalactiae, грамотрицательным штаммам Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и к дрожжевому грибу Сandida albicans методом диффузии в агар (лунок). Штаммы выращивали на жидкой среде мясо-пептонного бульона рН 7,3±0,2 при температуре от 30 до 35 0С в течение 18-20 часов. Культуры разводили 1:1000 в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида изотоническом, вносили по 1 мл в чашки с соответствующими элективными питательными средами для изучаемых тест-штаммов и засевали по методу «сплошного газона». Исследуемые образцы растворяли в 96% этиловом спирте в концентрации 1 мг/мл. Посевы инкубировали при 37 0С, учет растущих культур проводили через 24 часа. Препараты сравнения – нистатин, гентамицин и эвкалиптовое масло.
  • Диаметры зон задержки роста меньше 10 мм и сплошной рост в чашке оценивали как отсутствие антибактериальной активности, 10-15 мм - слабая активность, 15-20 мм - умеренно выраженная активность, свыше 20 мм – выраженная, - - отсутствие активности


Определение противотуберкулезной активности проводилось с использованием трех эталонных штаммов микобактерий Bovis-8 (бычий), Avium–780 (птичий), H37RV (человеческий) и полевого штамма, выделенного из образцов мокроты от больных с деструктивными формами туберкулеза легких. Растворы эфирных масел готовили в концентрациях по 300 мкг/мл. Затем 0,2 мл суспензий микобактерий смешивали с 0,3 мл эфирных масел, растирали с 2 мл 0,9% раствора хлорида натрия и помещали на 60 минут в термостат при температуре 37 оС. На окончательном этапе осуществляли посев обработанных культур на питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Так как в этом эксперименте были использованы пробирки с запарафинированными пробками, время наблюдения увеличено до 3 месяцев. Препарат сравнения – эфирное масло мяты перечной, которое используется при ингаляциях при комплексном лечении больных туберкулезом.

Определение цитотоксической активности Эфирные масла изучали методом выживаемости морских креветок Artemia salina.

Средой выведения морских рачков служил 3,3% раствор морской соли. 20 мг тестируемого эфирного масла растворяли в 2 мл этилового спирта, из которого отбирали по 500, 50, 5 мкл и разводили 5 мл морской воды по получения следующих концентраций 1000, 100, 10 мкг/мл. В каждый флакон переносили по 10 личинок, используя пастеровскую пипетку. Далее проводили инкубацию при температуре 25 - 27 оС при искусственном освещении, по окончании которой пересчитывали число выживших личинок. Затем с использованием полученных данных по верхнему и нижнему токсическому лимиту, рассчитывали половинную токсическую дозу каждого образца. Препарат сравнения – сесквитерпеновый лактон арглабин.
Острая и хроническая токсичность выделенных эфирных масел и полученных соединений проведена в лаборатории экспериментальной клинической фармакологии МНПХ «Фитохимия».

Доклинические и клинические испытания субстанции и новых фитопрепаратов на основе эфирных масел выполнены в медицинских учреждениях, определенных Приказом № 293 от 20.09.2006 г. Комитета по контролю за качеством медицинских услуг Минздрава РК.

Ранозаживляющее действие модельных мазевых форм эфирного масла аянии кустарничковой (ЭМАК) изучали на модели резаной кожной раны.

Эксперимент проводили на белых крысах, весом 170-230 г. Животных разделили на следующие группы:

  • контрольная группа без лечения - 6 крыс,
  • опытные группы, где применяли 1%, 3% и 5% мази ЭМАК на - жировой (3 группы) и гидрофильной (3 группы) основах - по 5 крыс в каждой группе , группа сравнения в которой применяли мазь левомеколь - 6 крыс.


Раны размером 400 мм2 смоделировали на выстриженном участке кожи спины животных. В начале иссекали участок кожи округлой формы размером 2х2 см (400 мм2.), затем с помощью хирургических ножниц надрезали кожу. Мази наносили шпателем в виде аппликаций без применения повязок и тампонов. Каждый день рану в начале обрабатывали 3 % раствором перекиси водорода, а затем наносили мази. Мази намазывали до полного покрытия эпителизации (заживления раны).

В ходе эксперимента оценивали общее состояние животных, степень выраженности воспалительной реакций, степень грануляций, эпителизации и заживления. Ежедневно измеряли размер раны, регистрировали наличие гноя, экссудации и общее состояние раневой поверхности. Критерием окончания лечения во всех случаях служила эпителизация раневой поверхности и покрытие ее шерстью.

Оценивали общее состояние животных, степень выраженности воспалительной реакции, сроки появления грануляций, эпителизации, заживления, динамику планиметрических показателей. Полученные результаты исследования сравнивали по группам.

При изучении ранозаживляющих свойств ни в одной группе не отмечено нарушения интегральных показателей: общего состояния, нарушений поведения, приема пищи, экскреции.

Результаты: в плане создания новых фармакологических препаратов изученные на компонентный состав эфирные масла, природные моно- и сесквитерпеноиды (компоненты эфирных масел), их производные испытаны на биологическую активность.

Изучение антимикробной активности 120 образцов эфирных масел и выделенных из них соединений проводилось по отношению к штаммам грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Str. Agalactiae, грамотрицательным штаммам Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa и к дрожжевому грибу Сandida albicans методом диффузии в агар (лунок).

Наименование образцов S. aureus Bacilus E. coli Candida Ps. Str.
505 subtilus M-17 albicans aeruginosa agalactiae
1 2 3 4 5 6 7
Эфирное масло полыни гладкой 24±0.2 25±0.2 20±0.2 22±0.2 23±0.1 23±0.1
«То же» цитварной 20±0.1 18±0.3 12±0.1 17±0.2 - 13±0.2
«» полыни селитряная 17±0.2 19±0.2 18±0.1 13±0.1 - -
«» укореняющейся 14±0.2 20±0.2 15±0.1 14±0.1 - -
«» полыни Филатовой 20±0.2 19±0.2 18±0.1 20±0.1 21±0.1
«» масло полыни беловатой 17±0.2 19±0.2 18±0.1 13±0.1 -
«»пижмы утесной 18±0.2 21±0.1 14±0.1 - -
«» пижмы улытауской 16±0.3 18±0.2 14±0.2 - - -
«» тимьяна частолистого 21±0.1 20±0.1 15±0.3 17±0.3 - -
«» тимьяна бритый 19±0.1 17±0.3 13±0.1 13±0.1 - -
«» тимьяна розового 24±0.1 20±0.1 15±0.2 12±0.1
«» таволги вязолистной 12±0.5 8 + 0,5 10 + 0,2 - - 2,0 + 0,1
«» зизифоры прерывчатой 10 ± 0,8 18+ 0,7 7 + 0,1 10 + 0,2 8,0 + 0,2
«» дороникума алтайского 16 ± 0.2 11 + 0,3 11 + 0,1 12 + 0.2
«» пикульника двухнадрезанного 12 ± 0,5 18 + 0,7 13+ 0,1 13 + 0,2
«» полыни метельчатой 12 ± 0,1 11 + 0,2 12 + 0,1 12.0 + 0,2
«» можжевельника ложноказачьего 11±0,1 11 + 0,2 12+ 0,2 11.0 + 0,3
«» полыни крупноцветковой 12 ± 0,1 11,0 +0,7 13 + 0,1 12 + 0,2
«» дудника низбегающего 15 ±0,1 17,0 +0,7 15 + 0,1 18 + 0,1
«» полыни шелковистой 12 ± 0,5 18,0 +0,1 13 + 0,1 13 + 0,1
«» шульции косматой 10,0 +0,1 12 + 0,1 16 + 0,1 13,0 + 0,1
«» живицы сосновой 28 ± 0,8 28,0 +0,1 12 + 0,1 15 + 0,1 21,0 + 0,2 16,0 + 0,1
«» аянии кустарничковой 13 + 0,2 14,0 +0,1 16 + 0,1 12 + 0,1 12,0 + 0,1 12,0 + 0,1
«» блошницы простертой 12 + 0,5 10,0 +0,5 10 + 0,2
«» полыни беловатой 12 + 0,8 18,0 +0,4 15 + 0,3 13 + 0,1 13,0 + 0,1 12,0 + 0,2
«» котовника украинского 24±0.1 25±0.2 19±0.1 21±0.1 23±0.1 25±0.1
«» тимьяна Маршалла 20±0.2 20±0.2 18±0.2 19±0.1
«» полыни тонковойлочной 21±0.2 21±0.2 20±0.2 23±0.2 23±0.1 23±0.1
2,12’-бис-хамазуленил 22±0,1 21±0,1 16±0,3 18±0,3 - -
Изоксазольное производное пулегона 14 ± 0,1 13,0 + 0,1 11 + 0,1 11 + 0,1
Камфора 10±3 11 ±3 13 ± 1 13±1
Сантолиновый спирт 13 + 0,1 12,0 +0,1 11 + 0,1 17 + 0,1 10,0 + 0,2 12,0 + 0,1
Диллапиол 11 + 0,1 13,0 +0,1 16 + 0,1 9,0 + 0,1 13,0 + 0,1
Буддледин С 14±0,2 13±0,1 15±0,3 14±0,1 - -
Оксим буддледина 17±0,1 16±0,2 13±0,1 14±0,2 - -
Монохлорпроизводное сантолинового спирта 17±0,2 18±0,2 14±0,1 13±0,2 - -
Лимонен 16±0,2 18±0,1 16±0,2 17±0,2 - -
1,8-Цинеол 19±0,1 16±0,1 15±0,3 16±0,2 - -
Дибромпроизводное диллапиола Отсутствие активности 15±0,2 14±0,3 16±0,2 - -
Дибромпроизводное апиола 13±0,3 14±0,2 14±0,3 - -
Эпоксид буддледина С 16±0,1 17±0,1 14±0,1 13±0,1 -
Оксим 3-бромкамфоры 18±0,1 16±0,3 13±0,3 16±0,2 - -
Бромгидрин D3-карена 14±0,1 15±0,2 14±0,1 12±0,1 - -
Дибромид D3-карена 14±0,1 13±0,1 16±0,2 - -
Тетрабромид лимонена 16±0,3 17±0,2 13±0,2 - -
Метилдец-2-ен-4,6-дииноат 18±0,2 16±0,1 14±0,1 16±0,2 - -
эвкалиптовое масло - 25,0 +0,1 - - - -
Цефалозин 22± 0,1 23 + 0,1 19 ± 0,2 -
Гентамицин 26,0±0,1 24,0 +0,1 23,0±0,2 24,0±0,1 23,0±0,1
Нистатин 22,0±0,1
Примечания
1 Зона задержки роста отсутствует
2 Диаметры зон задержки роста меньше 10 мм и сплошной рост в чашке оценивали как отсутствие антибактериальной активности, 10-15 мм - слабая активность, 15-20 мм - умеренно выраженная активность, свыше 20 мм – выраженная, - - отсутствие активности

В результате исследования выявлено, что слабую и умеренно выраженную антибактериальную активность как к грамотрицательным бактериям, так и по отношению к грамположительным бактериям показали образцы: эфирное масло таволги вязолистной, дороникума алтайского, пикульника двухнарезного, полыни метельчатой, полыни крупноцветковой, дудника нисбегающего, полыни шелковистой, шульции косматой, изоксазольное производное пулегона.

Практически все образцы проявили умеренно выраженную активность к грамположительным штаммам (St. аureus, Baс. subtilis). Умеренное антибактериальное действие по отношению к грамотрицательным бактериям (E. сoli) проявил один образец - эфирное масло дудника низбегающего. Хлорпроизводное сантолинового спирта и оксим буддледина показывают слабую антигрибковую активность в отношении Candida albicans.

Образец эпоксид буддледина С показал антибактериальную активность по отношению к грамположительным бактериям - S. aureus и Bacillus subtilus, водный 10%-ный раствор показал умеренно выраженную активность, отдельно необходимо отметить слабое ингибирующее действие в отношении палочки сине-зеленого гноя - Pseudomonas aeruginosa, которого не наблюдается у препарата сравнения линкомицина гидрохлорида и сопоставимо в сравнении с цефазолином.

Повышенный интерес для дальнейшего изучения и выделения индивидуальных компонентов, обладающих антибактериальными свойствами, представляют эфирные масла аянии кустарничковой, котовника украинского, тимьяна Маршалла, полыни тонковойлочной и полыни Филатовой, проявившие выраженную активность; а также эфирные масла полыни тонковойлочной и котовника кошачьего, проявившие выраженную противогрибковую активность.


Продолжение:

По материалам журнала «Практическая Фитотерапия»,
партнерского издания LIKAR.INFO”.